几种蛋白质提取方法的原理有什么？

写在前面······

Western Blot蛋白样品制备是实验的第一步，也是非常关键的一步，只有蛋白提得质量好，后面Western Blot跑出来的条带结果才美观又可靠。不同的样本，提取蛋白的方法不同，像诸如血浆、消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提直接进行分离。而胞内蛋白的抽提则需要先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到抽提液。

这一篇推文我们先对蛋白抽提的整体步骤和手段做一介绍，下面这张图系统地概括了严格意义上蛋白抽提的步骤，实际上对于我们大部分同学来说，只做到红框里的内容就足以满足实验需求了：

下面我们来介绍一下总体步骤：

一、分离组织/细胞

组织/细胞分离需要主要依据实验目的选择所需的实验材料：

1、培养的悬浮细胞或细菌菌液，或者血液、尿液、胸腔积液等体液可直接离心收集待用；

2、贴壁培养的细胞用PBS清洗后收集待用；

3、动物组织或手术标本，必须新鲜处理，取得实验所需的脏器或组织，剔除结缔组织及脂肪组织后用预冷的生理盐水或PBS洗去血液或其他体液（如心脏、大脑、肝脏等必要时可以用灌注法洗去脏器内部血液），再用滤纸吸去多余水分后收集待用。如不能立即进行实验，需要冻到-80℃。

二、组织/细胞破碎裂解

除了分泌型细胞外蛋白可以直接离心使用外，更多时候我们需要先将组织/细胞破碎，使蛋白充分释放到溶液中，才能进行后续提蛋白操作。不同生物体或同一生物体的不同组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰腺、肝脏、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器研磨即可；肌肉及心脏组织较韧，需预先绞碎再制成匀浆。常用组织细胞的破碎方法如下：

（一）研磨或匀浆

适用于组织材料，取适量组织剪碎后加入适当的生理盐水或PBS等缓冲液后进行研磨或匀浆：

1.研钵研磨

将研钵置于冰上预冷，将组织及缓冲液放入后用力研磨成稠糊状，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细（在磨细时局部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时，另外磨细剂的吸附也可导致蛋白质的损失），离心后取上清液。

2.手持式电动匀浆器

多数为硬质塑料材质，靠钻头与EP管内壁两个面摩擦将组织磨碎。由于两面间隔只有几十至几百微米，对细胞破碎程度比高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。

3.高通量组织破碎仪

加入适量的金属或玻璃等不同材质的珠子，靠机器高速敲击管壁震动从而使得组织破碎。

（二）超声波处理法

用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。超声的频率和功率根据实验目的不同而改变，超声时需要分为几个周期，比如超声几秒，停几秒，一共超声多少次，一般超声5-10s，反复多次。超声的优点在于耗时短，肽链提取片段长度更可控，回收率更高。缺点是在处理过程较难避免溶液中出现气泡，并容易大量产热，需要让容器置于冰上，过强的超声波可导致多聚物降解和蛋白失活。如果超声出现沉淀说明超声功率太大。

（三）反复冻融法

在冰箱冷藏或干冰中-20～-15℃冻固后，再缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织变性，冰晶碎片将细胞膜刺碎，使蛋白质可溶化，成为黏稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。这个方法成本低，操作简便，单过程缓慢，不适用于对温度比较敏感的蛋白质。

（四）酶法

使用分解细胞壁或细胞膜成分的酶类使得细胞破裂。如溶菌酶能专一性地破坏细菌细胞壁；水解糖肽组分的β-1，4-糖苷键，使细胞内含物释放出来，特别适用于革兰氏阳性细菌。

（五）有机溶剂法

粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，脱脂和脱水后变为干燥粉末。用少量乙醚洗涤，经滤纸干燥后，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。

（六）表面活性剂法

这个是我们实验中相对用得比较多的方法。常用的溶剂的有十二烷基磺酸钠（SDS）、氯化十二烷基吡啶及去氧胆酸钠等，非离子型表面活性剂吐温40（Tween 40）或Triton X-100等，这些溶剂能破坏细胞膜使细胞瓦解，有时使蛋白质更易溶解，除去表面活性剂后蛋白质仍留在上清液中。

以上方法普遍适用大多数样本，无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子降解，导致天然物质量的减少。加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制活性中心需要有巯基的蛋白水解酶的活性；加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力；还可通过调整pH、温度或离子强度等，使之适合于目的蛋白质的提取。

三、提取目的蛋白

蛋白质提取的基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于相同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中。因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。

（一）水溶液提取法

抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶的活力，以减少细胞的自溶过程。主要通过选择适当pH，温度或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。

稀盐缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1～5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解，提取的温度要视有效成分性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此温度高利于溶解，缩短提取时间。另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此基于这一点考虑提取蛋白质时一般采用低温（4℃以下）操作。为了避免蛋白质在提取过程中降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸、碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH和盐浓度的选择。

1.pH

蛋白质是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2.盐浓度

稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜，这也是为什么我们在做免疫共沉淀时的RIPA裂解液里含有150 mM NaCl。缓冲液常采用0.02～0.05mol/L磷酸盐和碳酸盐的等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂。它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白提取液，但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起蛋白质的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

好了，今天就总结到这里，总的来说蛋白样品制备决定成败的关键一步，后面我会详细总结抽提细胞蛋白的步骤和一些避雷操作，别忘了点赞、转发、关注，让我有动力继续分享！

参考文献

[1] J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]. 科学出版社, 2002.

[2] 林秋雄, 吴炳义. 生物医学基础研究使用手册[M]. 人民卫生出版社, 2021

[3] 陶永光. 肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册[M]. 湖南科学技术出版社, 2014.

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